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锘海LS18平铺光片显微镜助力发现量子点致斑马鱼幼鱼水肿的主要原因有肾脏损伤

发布日期:2024/2/6 13:56:15

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近期,厦门大学左正宏教授团队在《Science of the Total Environment》杂志上发表了题为"Kidney injury contributes to edema of zebrafish larvae caused by quantum dots"的研究论文。该研究的主要目标是探讨肾脏在InP/ZnS 量子点(QD)引起的斑马鱼水肿中的潜在调节作用。此项研究深入探讨了受精后(dpf)斑马鱼幼鱼暴露于InP/ZnS QD后7天形成水肿的病因学因素。该研究采用了转基因斑马鱼系,其特征为荧光蛋白标记的肾小球、肾小管和血管,并结合组织病理学检查,发现InP/ZnS量子点诱导下前肾内出现明显形态和结构畸变。通过组织质谱成像和高光谱显微镜观察到,在前肾中积累了InP/ZnS QD。此外,FITC-葡聚糖摄取减少证实InP/ZnS QDs阻碍了前肾的清除能力。同时,在水肿发生之前早期时间点上观察到与肾脏发展和渗透调节功能相关的标记基因表达水平被InP/ZnS QDs干扰。总而言之,该研究提供了一个观点:外源物质引起的肾脏损伤可能会调节斑马鱼模型中的水肿。
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研究方法:

1、采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、质谱成像和高光谱成像评估InP/ZnS QD在肾脏中的积累。

2、利用标记有肾小球、肾小管和血管不同荧光蛋白的转基因系,分析斑马鱼前肾在暴露于InP/ZnS QD后是否存在形态异常,并进行组织学实验。

3、通过将转基因斑马鱼品系Tg(pod:Gal4; UAS:NTR-mCherry)雌性与Tg(fil1a:EGFP)雄性杂交,在光片荧光显微镜下研究InP/ZnS QDs对肾小球发育的影响。

4、注射异硫氰酸荧光素(FITC)-葡聚糖来评价InP/ZnS QD暴露后对肾小球滤过功能的影响。

5、利用实时定量聚合酶链反应(qPCR)定量分析与肾脏发育、水盐平衡和渗透调节功能相关的基因表达。


研究结果:

  • 对多种纳米材料进行筛选后发现,CdSe/ZnS和InP/ZnS QD会导致斑马鱼出现水肿和肾小球荧光扩散的现象。



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图 1. InP/ZnS QD 的表征。


(A) InP/ZnS QD 的 TEM 和直径分布的统计分析(插图)。(B) InP/ZnS QD 在 500 × 500 nm 扫描区域中的 AFM 图像。(C) InP/ZnS QD 的拉曼光谱。(D) 在超纯水和培养基中的流体动力学直径。(E) 在超纯水和斑马鱼培养基中的 Zeta 电位。所提供的数据为平均值±SEM。(F) InP/ZnS QD 的稳态吸光度和归一化 PL 光谱。λex=375 nm。(G) 白色和蓝色 LED 连续照射下 PL 强度的变化。λex=468 nm。


  • 在0.01、0.1和1 mg/L浓度下暴露于InP/ZnS QD并不具有致命性,并且也不会影响幼鱼的孵化。然而,在1 mg/L InP/ZnS QD暴露下,斑马鱼的水肿率和程度显著增加。


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图 2. InP/ZnS QD 暴露诱导斑马鱼水肿。


(A) 3-7 dpf 暴露于 0、0.01、0.1 和 1 mg/L InP/ZnS QD 下的斑马鱼形态。红色箭头:心包水肿;蓝色箭头:卵黄囊水肿;黑色箭头:眶周水肿。(B) 暴露于 InP/ZnS QD 的斑马鱼的存活率。(C) 暴露于 InP/ZnS QD 的斑马鱼的水肿率。结果表示为平均值±SEM。p < 0.05 时差异被认为是显著的。不同的字母代表同一时间点两组之间的显著差异。


  • 质谱和高光谱分析结果表明InP/ZnS QD 会在前肾中积累;

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图3. 斑马鱼幼鱼对 InP/ZnS QD 的摄取。


 (A) 肾小球水平幼鱼横截面示意图,标记成分包括 PCT(近曲小管)、bs(鲍曼间隙)、pht(原肾造血组织)、cl(毛细血管袢)、 n(脊索)、da(背主动脉)、cv(尾静脉)和sb(鳔)。(B) 7 dpf 时斑马鱼幼鱼体内 In-115 的全身负荷。数据表示为平均值±SEM,n = 4。p < 0.05时差异被认为是显著的。不同的字母代表两组之间的显著差异。(C) 4 dpf 时斑马鱼的典型质谱图像。白色虚线圆圈、肾小球和PCT。ND:未检测到。数据表示为平均值±SEM,n = 3。(D)暴露于实验条件4 天的斑马鱼前肾的 EDHM 图像。图1 显示肾小球的放大视图,而图 2 显示 PCT 的放大视图。InP/ZnS QD 的较小信号由箭头表示,InP/ZnS QD 的高光谱信息以红色像素可视化。


  • 使用光片荧光显微镜与共聚焦显微镜(7dpf的斑马鱼先用锘海试剂盒透明化后使用锘海LS18平铺光片显微镜成像)对暴露于1 mg/L InP/ZnS量子点的斑马鱼在4 dpf和7 dpf时进行观察,结果显示InP/ZnS量子点影响了前肾发育,包括引起肾小球肿胀、毛细血管簇异常以及损伤了肾小管结构。

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图 4. InP/ZnS QD 对斑马鱼幼鱼肾小球和肾近端小管的形态产生不利影响。


(A) 4 dpf Tg ( pod: Gal4; UAS: NTR - mCherry; fil1a: EGFP )肾小球足细胞(红色荧光)和毛细血管簇(白色虚线圆圈中的绿色荧光)的活体光片荧光显微镜成像。(B) 7 dpf Tg ( pod: Gal4; UAS: NTR - mCherry; fil1a: EGFP ) 肾小球足细胞(红色荧光)和毛细血管簇(白色虚线圆圈中的绿色荧光)的光片荧光显微镜成像。这些图像是斑马鱼的俯视图。(C) 在荧光体视显微镜下 4 dpf 和 7 dpf 时Tg ( gtshβ: GFP ) 肾近端小管的代表性图像。(D) 激光共聚焦显微镜下 4 dpf 时斑马鱼肾近端小管的代表性图像。这些图片是斑马鱼的侧视图。


  • 组织学实验结果表明InP/ZnS QD 会导致斑马鱼肾小球和肾小管变性;


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图 5. 使用 H&E 染色观察 InP/ZnS QD 暴露引起的肾小球形态变化。


(A) 斑马鱼前肾的代表性图像。n:脊索;da:背主动脉;cl:毛细管环;p:足细胞;bs:鲍曼空间;pct:近曲小管。(B) 肾小球表面积的定量 (n = 5)。(C) 幼鱼细胞核定量 (n = 5)。(D) 幼鱼每 100 μm2肾小球表面的细胞核定量 (n = 5)。(E) 鲍曼空间面积的定量 (n = 5)。数据表示为平均值±SEM。p < 0.05 时差异被认为是显著的。不同的字母代表两组之间的显著差异。


  • 注射FITC-葡聚糖的葡萄糖和右旋糖酐清除率结果表明InP/ZnS QD 暴露会损害斑马鱼肾小球滤过能力;


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图 7. 通过注射 FITC 标记的葡聚糖来测定 QD 暴露后斑马鱼的肾小球滤过。


(A) 肾小球滤过率 (GFR) 测试程序的方案。按照时间线,注射两批FITC-葡聚糖(3.5和6.5 dpf),并在4 dpf (12 hpi)、4.5 dpf (24 hpi)时拍摄照片和统计荧光强度;分别为 7 dpf (12 hpi) 和 7.5 dpf (24 hpi)。(B) 和(C) 3.5 和 6.5 dpf 注射后 12 和 24 小时的荧光图像 (FITC)。荧光定量感兴趣的注射区域用白色方块突出显示。(D) 和 (E) 分别在 3.5 dpf 和6.5 dpf 注射时对 InP/ZnS QD 处理的幼虫的肾脏 FITC-葡聚糖清除率进行定量。AU:任意单位,hpi:注射后小时。数据表示为平均值±SEM。 p < 0.05时差异被认为是显著的。不同的字母代表两组之间的显著差异。


  • 通过qRT-PCR检测相关基因mRNA表达变化来探究与斑马鱼中涉及到肾脏发展、渗透调节以及酸/碱平衡功能有关基因之间可能存在联系。结果显示,在受到InP / Zn S QD 暴露之前就可能出现与水体积增加相关联的一些潜在问题。

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 8. 使用 qRT-PCR 检测参与前肾发育和功能的基因的 mRNA 表达水平。


 (A) 从背视图呈现斑马鱼幼虫内的前肾位置和前肾结构,每个部分都用下面的颜色图表进行颜色编码。P:足细胞;CT:毛细血管簇;N:颈段;PCT:原肾曲小管;PST:近端直小管;DET:远端早期小管;DLS:远端晚段;PD:前肾管;C:泄殖腔。斑马鱼前肾2 dpf表达基因片段分布,参考Elmonem et al. 2018。(B-H)在 InP/ZnS QD 暴露 2、4 和 7 dpf 期间,对斑马鱼与肾脏发育和功能相关的转录本进行了分析。n = 3–4(每个 12 个胚胎/幼鱼)重复运行。数据表示为平均值±SEM。p < 0.05时差异被认为是显著的。不同的字母代表同一时间点两组之间的显著差异。


研究意义:


鱼类水肿是水生发育毒性的常见症状。迄今为止,对于水肿的原因进行的研究很少。该研究强调了InP/ZnS QD对斑马鱼前肾发育的毒性,并阐明斑马鱼肾脏发育缺陷可能是导致水肿的原因之一。该研究结果表明,暴露于InP/ZnS QD会导致前肾出现明显的形态和结构缺陷,并降低其清除率。此外,暴露于InP/ZnS QD还会显著改变与肾脏发育和渗透调节功能相关基因的表达水平。总体而言,该研究揭示了InP/ZnS量子点引起斑马鱼前肾发展和功能缺陷,从而扰乱体内水盐稳态并可能导致水肿问题。


厦门大学生命科学学院何承勇副教授为本论文通讯作者,厦门大学生命科学学院王鸾金为第一作者。该研究得到国家自然科学基金、福建省自然科学基金资助。

锘海助力:

锘海提供组织透明化服务与平铺光片显微镜成像服务支持本次研究。将7天后转基因(pod: Gal4; UAS: NTR - mCherry; fil1a: EGFP)斑马鱼暴露于浓度为1 mg/L InP/ZnS QD中并在配制有1X PBS 4% PFA中固定过夜后进行处理。随后使用锘海试剂盒进行透明化处理,并利用锘海LS18平铺光片显微镜0.6NA 25X进行三维成像分析如下图所示结果可知,在与对照组相比较时,7天后暴露于浓度为1 mg/L InP/ZnS QDs中的斑马鱼显示出mCherry荧光减弱现象存在于其小球区域;同时近端小管区域仍保留着mCherry荧光信号;此外还观察到了小球毛细血管丛退化情况 。通过Tg(gtsh?: GFP) 斑马鱼模型评估近端小管区域发展情况时也观察到了近端小管荧光强度减弱及其分布不均等特征 。这些结果说明InP / ZnS QD影响着前期胚胎期间斑马鱼前部尤其是小球区域以及近端小管区域正常发展 ,包括造成了小球增大、损害了毛细血管丛以及造成近段输尿管损伤等问题。


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图4. (B) 7 dpf Tg ( pod: Gal4; UAS: NTR - mCherry; fil1a: EGFP ) 肾小球足细胞(红色荧光)和毛细血管簇(白色虚线圆圈中的绿色荧光)的光片荧光显微镜成像。


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使用锘海试剂盒进行透明化处理,并利用锘海LS18平铺光片显微镜进行三维成像分析




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