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显微成像小课堂丨荧光显微镜的应用

发布日期:2019/8/9 15:02:01

全内反射荧光显微镜(TIRFM)是一种利用光束在两种不同折射率介质之间传播产生的消逝波探测荧光标记活细胞表面的技术。实际中,当入射激光束遇到盖玻片和含有细胞的水介质之间的界面时,它以临界角(全内反射)反射。因为消逝波的能量随距盖玻片的距离呈指数下降,只有在表面(10到200纳米之间)10纳米范围内的荧光团受到消逝波的激发,而距离较远的荧光团基本上不受影响。因此,TIRFM会导致位于盖片附近的荧光团产生高信号水平,叠加在非常暗的背景上,从而提供了极佳的信噪比。激发深度的极端限制对于研究盖玻片表面附近的粘附细胞中单分子或膜和细胞器组成(参见图8(e))是十分理想的。由于激发仅限于盖玻片附近的薄区域,因此光漂白和光毒性也仅限于这些区域,这使得TIRFM成为长期观察最有用的方法之一。该技术已成为研究细胞和分子生物学中广泛现象的基本工具。

反卷积处理是一种应用于沿光学(Z)轴获取的一组全聚焦图像的算法,以增强对于给定图像平面或多个焦平面图像叠加中的光子信号。显微镜必须配备高精度的电动聚焦驱动器,以保证在样品的焦平面之间以精确定义的间隔进行图像采集。在一个典型的应用中(见图8(f)),反卷积处理被用于去模糊以及从指定焦平面上去除使用宽场荧光激发和发射聚焦外的光。最复杂的应用是将反卷积处理应用于整个图像堆叠中生成投射视图或三维模型。用于反卷积处理的一组宽场图像捕获了样本发射的理论最大光子数。反卷积过程是将焦平面上方和下方发射的光子产生的“模糊”强度重新分配给原始平面。因此,反卷积几乎使用了所有可用的发射强度,并提供了最佳的光预算,从而使这项技术成为非常光敏的样品的选择方法。

共振能量转移现象在荧光显微镜上的一种变种,荧光或F?rster共振能量转移(FRET)用来获得活细胞内蛋白质、脂类、酶和核酸结合和相互作用的量化的时间和空间信息。FRET可以采用恒定状态或时间分辨技术,但时间分辨的FRET成像具有更精确地映射供体-受体距离的优点。一台标准的宽场荧光显微镜,配备适当的激发和发射滤光片和一个灵敏的摄像机就可以用来进行FRET成像。将对环境敏感的蛋白质或肽夹在两种FRET适用的荧光蛋白之间的生物传感器目前在细胞生物学中得到广泛应用。这些探针很容易在宽场荧光显微镜下用敏化发射FRET技术结合比率分析成像。此外,利用激光扫描共聚焦显微镜进行光谱成像和线性解混有助于监测生物传感器和其他荧光蛋白应用中的FRET现象。

荧光寿命成像显微镜(FLIM)是一种复杂的技术,能够同时记录图像中每个位置的荧光寿命和荧光团空间位置。该方法提供了一种机制来研究环境参数,如pH值、离子浓度、溶剂极性、非共价相互作用、粘度和单个活细胞中的氧张力,并以空间和时间阵列呈现数据。FLIM对纳秒级激发态寿命的测量与局部荧光团浓度、光漂白影响和路径长度(样品厚度)无关,但对激发态反应(如共振能量转移)敏感。事实上,将FLIM与FRET结合,通过监测荧光供体在共振能量转移前后的寿命变化,被认为是研究这一现象的最佳方法之一。

荧光标记大分子和小荧光团的迁移率(横向扩散系数)可通过荧光漂白后恢复(FRAP)技术测定。在FRAP中,一个非常小的选定区域(直径几微米)受到强烈的光照,通常是用激光,以产生该区域荧光团的完全光漂白。结果是荧光的急剧减少或湮灭。在光漂白脉冲之后,在低激发强度下监测漂白区域荧光强度恢复的速率和程度与时间的函数关系,以生成荧光团重新填充和恢复动力学的信息(图9)。FRAP通常使用EGFP或其他荧光蛋白进行。相关的光活化技术是基于特殊的合成笼状荧光团或类似功能的荧光蛋白,这些荧光蛋白可以被紫外或紫的短脉冲激活。光活化和FRAP可作为确定迁移率参数的补充技术。

一项与FRAP相关的技术中,称为荧光漂白后损失(FLIP),活细胞内的一个确定的荧光区域通过强辐照进行重复的光漂白。在测量的时间段内,如果所有荧光团都能够扩散到正在被光漂白的区域,则此操作将导致整个细胞的荧光信号完全丢失。通过计算荧光从整个细胞中消失的速率,可以确定目标荧光团的扩散迁移率。此外,FLIP还可以很容易地识别细胞各个隔层之间任何扩散屏障的位置和性质,例如神经元的体细胞和轴突之间的屏障。

荧光相关光谱学(FCS)主要用于激光扫描共聚焦显微镜或多光子显微镜,它是一种设计用于确定体积在含有一个或几个分子大小的动力学信息,比如化学反应速率、扩散系数、分子量、流速和聚集的技术。在FCS中,用聚焦激光束照射一个小体积(大约一飞米;激光的衍射极限焦点)以记录荧光分子动力学引起的自发荧光强度波动,荧光分子占体积的时间函数(图10)。相对较小的荧光团在被照射的体积中迅速扩散,产生短期的随机强度爆发。相反,较大的复合物(与大分子结合的荧光团)移动更慢,产生更长、更持久的时间依赖性荧光强度图案


当荧光标记的结构在活细胞的特定区域内密集排列和重叠时,它们的动力学和空间分布是很难分析的。荧光斑点显微镜(FSM)是一种与几乎所有成像方式兼容的技术,利用浓度非常低的荧光标记亚单位的优势,减少离焦荧光,提高在厚区域内标记结构及其动态可视性。FSM是通过只标记感兴趣的整个结构的一小部分来实现的。从这个意义上讲,FSM类似于在整个视场下执行FCS,尽管它更强调的是空间模式而不是定量的时间分析。荧光斑点显微镜在确定细胞骨架元素(如肌动蛋白和微管)在高活性细胞中的流动性和聚合性方面特别有用。

受激发射损耗显微镜(STED)是一种新兴的超分辨率技术,它的空间分辨率远远超过衍射极限,使用环形损耗光包围一束较小的激发光,以获得低于50纳米的轴向分辨率。这项技术依赖于利用同步激光脉冲激发荧光团和空间协调的圆形STED脉冲损耗发射光,抑制激光扫描焦点周围受激发的分子的荧光。在斑点的周围所产生的荧光被抑制,但斑点中心没有,因此显著减小荧光斑点的尺寸,相应的分辨率会显著的增加。STED已被证明是高分辨率检测活细胞的有用工具。其他新兴的超分辨率技术,如光激活定位显微镜(PALM)和结构光照明显微镜(SIM),在不久的将来也会成为活细胞成像的基本工具。

基因编码荧光蛋白和先进合成荧光团在活细胞成像中的应用越来越多,为监测时间动态和空间关系打开了一扇新的光学模式的大门。现在,显微镜学家有了一套完整的工具来观察和记录在大范围时间尺度和多分辨率下发生的细胞过程的图像数据。利用激光扫描共聚焦显微镜可以很容易地观察和记录较慢的事件,而使用转盘技术可以获得更快的动力学事件。此外,多光子显微镜能够在厚组织中进行深层成像,全内反射技术能够以共聚焦精度探测膜表面。先进的荧光方法,如FRET、FLIM、FRAP、FCS、FSM、SIM、PALM和STED,可用于监测蛋白质-蛋白质间相互作用,其分辨率通常优于衍射极限所允许的分辨率。随着荧光团、显微镜和检测器技术的日新月异,一个更广泛的世界将被“置于显微镜之下”。


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