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显微成像小课堂丨透射光成像技术

发布日期:2019/7/26 16:13:00

无论多么复杂的成像技术,都可以分为两类。一类是透射光技术,也就是我们俗称的明场或明视野,这里的明场其实是一个广义的明场,具体又可以分为明场(Bright Field,BF);微分干涉对比(Differential Interference Contrast,DIC);霍夫曼调制对比(Hoffman Modulation Contrast,HMC);相差(Phase Contrast,PH);偏光(Polarized Light);暗场(Dark Field,DF)。另一类就是荧光技术。一些复杂的新颖的成像技术,例如光片显微镜,共聚焦显微镜,双光子显微镜,都是基于荧光成像技术发展而来的。今天先介绍最基础的透射光技术~~~


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明场显微镜和透射光技术

在过去的三个世纪里,在各种光学显微镜中使用的主要和最受欢迎的技术之一,明场照明,是依靠折射率或颜色的变化来产生对比度。当光通过样品,物镜收集和聚焦光线时,改变了波前的方向、速度、光谱的区域会产生光学差异(对比度)。明场系统的分辨率取决于物镜和聚光镜的数值孔径,对于数值孔径组合超过1的情况,通常需要在试样的两侧使用浸没介质。数码相机提供了广泛的动态范围和所需的空间分辨率,以捕捉在明场图像中存在的信息。此外,扣除光路中没有样本时的平均帧背景算法可以显著增加对比度。

简单的明场成像,通过适当调整显微镜的科勒照明,提供了关于细胞轮廓、核位置和较大囊泡位置的有限程度的信息(见图2(a))。然而,明场模式中的对比度普遍不足,这使得该技术在对细胞结构和功能的深入研究时相对无用。增强对比度的方法包括微分干涉对比(DIC)、偏振光、相差、霍夫曼调制对比和暗场显微镜(示例如图2所示)。一些技术受制于对较厚植物和动物组织成像时远离焦平面的区域产生的光,而偏振光需要双折射来产生对比度,通常在动物细胞中很大程度是不存在。图2(a)所示的是中国仓鼠卵巢粘附细胞在无光学对比增强方法下的明场照明成像。与图中的其他图像相比,可以说基本没有对比度。单个细胞很难区分,大多数内部特征(例如细胞核)在这张图像中不可见。

微分干涉对比显微镜(图2(b)和图3(a))需要平面偏振光和附加的光剪切(Nomarski或Wollaston,所以有时DIC也会被称为Nomarski DIC)棱镜来放大样品厚度梯度和折射率的微小差异。例如,由于细胞的水相和脂质相的折射率不同,脂质双层在微分干涉对比中能产生很好的对比度。此外,相对平坦的贴壁哺乳动物细胞和植物细胞,包括质膜、核、液泡、线粒体和应激纤维的细胞边界,通常会产生显著的梯度,很容易用DIC成像。在植物组织中,双折射细胞壁在一定程度上降低了DIC的对比度,但是一个校正得当的系统可以使得在表皮细胞中看到核膜、空泡膜、线粒体、叶绿体和浓缩染色体。


偏光显微镜(图2(f)和图3(b))是通过观察正交偏振元件之间的样品来进行的。细胞内具有双折射特性的部分,如植物细胞壁、淀粉颗粒、有丝分裂纺锤体以及肌肉组织,旋转光的偏振平面,使观察的部分在黑暗背景下显得明亮。图2(f)所示的兔肌肉组织是应用偏光显微镜观察活组织的一个例子。需要注意的是,这种技术受到活细胞和组织中少见的双折射现象的限制。上面提到的微分干涉对比是通过在正交偏振器之间放置一对相对的Nomarski棱镜来进行操作的,因此,任何配备了DIC观测的显微镜也可以通过从光路中移除Nomarski棱镜来检查平面偏振光中的样品。

使用最广泛的相差技术(如图2(c)和图4(a)所示)采用光学机制将相位的微小变化转化为相应的振幅变化,在视觉上的表现就是图像对比度的差异。显微镜必须配备一个专门的聚光镜,聚光镜中包含一系列环形物与相差物镜一一对应,相差物镜在后焦平面中包含相差环(相差物镜也可与荧光一起使用,但透射率略有降低)。对培养中的活细胞观察或成像时,相差是一种很好的增强对比度的方法,但通常会导致边缘特征轮廓周围出现过多的光晕。这些光晕是光学伪影,通常会降低边界细节的可见性。这项技术对于厚样本(如植物和动物组织切片)用处不明显,因为发生在远离焦平面区域的相位偏移会扭曲图像的细节。此外,漂浮的碎片和其他离焦的物体会干扰盖片上粘附细胞的成像。

霍夫曼调制对比通常被比喻为“穷人的DIC”,它是一种斜照明技术,通过检测光学相位梯度来增强活细胞和组织的对比度(见图2(d)和图4(b))。显微镜的基本结构包括一个光学振幅空间滤波器,称为调制器,位于物镜的后焦平面。通过调制器的光强在平均值的上下变化,根据定义,平均值被称为调制。与物镜调制器耦合的是一个离轴狭缝孔,该狭缝孔位于聚光镜前焦平面内,用来将照明光倾斜指向样品。与相差显微镜中的相位环板不同,霍夫曼调制器的设计不改变光通过的相位,而是影响主要的零级光的最大值以产生对比度。霍夫曼调制对比不受双折射材料(如塑料培养皿)在光路中的使用的阻碍,因此该技术更适用于在聚合物材料制成的容器中检测样品。在缺点上,霍夫曼调制对比(HMC)产生了许多光学伪影,使该技术在某些方面不如用相差或DIC对在玻璃盖片上活细胞成像有用。


围绕暗场显微镜的方法,尽管在整个十九世纪和二十世纪广泛应用于透明标本成像,但仅限于用于物理分离的细胞和生物体(如图2(e)所示)。在这项技术中,聚光镜在高方位角将一个光锥导向样品,这样一阶波前就不会直接进入物镜前透镜元件。通过样品的光被光学不连续性的(如细胞膜、细胞核和内部细胞器)衍射、反射和/或折射,使这些微弱的光线进入物镜。然后,样本可以在黑色背景上呈现为明亮的物体。不幸的是,从远离焦平面上的物体散射的光也会对图像产生影响,从而降低对比度并模糊样品的细节。由于成像室中的灰尘和碎片对生成的图像也有显著影响,这一伪影更加复杂。此外,粘附的细胞很薄,信号很微弱,而厚的动植物组织会将太多的光引入物镜光路中,从而降低了该技术的有效性。

以上介绍的就是几种基本的用来增加对比度的方法,但是归根结底,透射光技术有局限性,例如不可避免的光学伪影;另外,即使针对样品选择了最适合的观察方法,但是仅仅在明暗上增加对比度的方法还是很难对活细胞进行更深入的研究。下节课我们将介绍荧光成像技术,这一技术的引入将对活细胞的研究带入了一个全新的领域。



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