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显微成像小课堂丨活细胞成像方法

发布日期:2019/7/29 11:37:00

之前的课上介绍了一套完整的活细胞成像系统必不可少的几个主要部分,相信大家对活细胞成像系统已经有了一定的认识。简单的总结一下,一套优秀的活细胞成像系统,需要一套高效,耐用的光源,无论对于透射光还是荧光来说,LED都是最佳的选择;其次,是高分辨率的,满足不同培养器皿成像需求的物镜;最后,当然是一个高灵敏度的快速的相机。

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对活细胞成像系统的介绍暂时告一段落,接下来,将从方法上介绍几种不同的活细胞成像手段,有传统的,也有新兴的。本节课主要让大家有一个宏观的认识。


Unit Two    Lesson 1

传统的活细胞成像方法是基于短期或长期的延时研究,旨在使用常见的对比增强技术监测细胞运动和动态事件,包括明场、差分干涉对比(DIC)、霍夫曼调制对比(HMC)、相差和宽场荧光。然而,现代技术和新引进的方法使这些观察方法远远超出简单地对细胞结构和功能创建录像序列,而是将对组织,细胞和亚细胞结构的动态活动的监控,测量,干扰这些特别的方式集成到延时成像中。

大多数活细胞成像研究是用附着的哺乳动物细胞进行的,这些细胞位于盖玻片与介质界面间10微米范围内。然而,研究人员越来越多地将注意力转向更厚的动植物组织标本,其厚度范围从10到200微米不等。实际上,在所有使用宽场显微镜的活细胞成像实验中,细胞质的搅动会造成曝光时间的限制,失焦信息会使图像变模糊。用于对动物组织和植物的明场和荧光成像方法必须考虑到这些标本对曝光的敏感性以及与解决位于标本中20至30微米以上的特征相关的问题。

明场技术通常对活细胞危害较小,但利用透射光观察特定蛋白质的方法尚未得到广泛发展。在明场图像中产生高对比度色度(颜色)或强度差(明暗)比在黑暗或黑色背景下识别发光强度变化(实际上是由于荧光)更困难。因此,明场技术在观察细胞器或整个细胞的行为中得到了应用,而荧光方法,包括共聚焦技术,通常用于观察特定的分子。




图一所示的是目前常见的用于宽场和扫描荧光显微镜的成像方式。宽场、激光扫描、转盘和多光子技术采用了截然不同的照明和检测方法来成像。上图说明了在盖玻片上附着的哺乳动物细胞,除了传统的宽场荧光外,还可以被全内反射(TIRFM)、激光扫描共聚焦、多光子和转盘共聚焦照亮。每种技术的检测区域都以红色图案表示。在宽场中,样品在整个场以及焦平面的上方和下方都被照亮。每个点源被扩散成一个被称为点扩散函数(PSF)的类似于双倒锥的形状。只有该形状的中间部分位于焦平面中,其余部分离焦会导致模糊,从而降低图像质量。

相比之下,激光扫描共聚焦、多光子和转盘共聚焦显微镜用紧聚焦的激光扫描标本。发射光成一个点扩散函数形状。激光扫描共聚焦显微镜由一个聚焦的激光光斑扫描整个样品,光路中的共轭针孔阻止来自焦平面以外的荧光影响光电倍增管采集信号。在转盘共聚焦显微镜中,针孔或狭缝孔阵列被放置在旋转圆盘上,在某些情况下装有微透镜元件,使得这些孔快速扫过样品,并用面阵列检测器(数码相机)记录图像。在多光子显微镜中,光子通量高到足以用一个以上光子激发位于点扩散函数焦点位置的荧光团,所以荧光团激发只发生在焦点上,因为所有的荧光都是从聚焦荧光团发出的,所以不需要针孔,而且发出的荧光会产生清晰的聚焦图像。

以上就是几种常见的活细胞成像方法:传统的对比增强技术,比如DIC,HMC,PH;全内反射;激光扫描共聚焦,也包括转盘共聚焦;还有多光子等等,在接下来的课中,会一一介绍。



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