86-021-37827858
EN
您当前的位置: 首页 >新闻资讯 >新闻资讯

NEWS

新闻资讯

新型外泌体分离纯化技术——新西兰qEV尺寸排阻色谱柱

发布日期:2018/4/20 11:12:55

细胞外囊泡 (Extracellular Vesicles, EVs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体,其在各种细胞活动过程中起重要作用,例如细胞间通讯、炎症、细胞稳态、存活、转运和再生。从细胞培养上清液和复杂的生物体液(如血浆)中分离和分析EVs具有很大的临床潜力,可以为各种疾病诊断和预后提供有用的信息。尽管目前研究者们对这一领域产生了越来越多的科研和临床研究兴趣,但仍然没有一种最有效的方法用于获得高质量且高纯度的EVs。

图1 细胞外囊泡EVs



为此,Richard 等人从分离效率、产量和纯度方面综合比较分析了各种外泌体分离方法,如超离法、超滤法、密度梯度离心法、化学沉淀法和qEV尺寸排阻色谱法。

首先,研究者对传统的外泌体提纯方法进行比较,结果发现:超离法虽操作简单,但外泌体的产量较低;超滤法在分离效率、产量和纯度方面都优于超离法,但其纯度仍然相对较低,不适合大规模的样品分析,见图2。

图2 超离法和超滤法的对比结果。(b)外泌体浓度对比,UF>UC(c)外泌体回收率对比UF>UC(d)外泌体粒径分布对比. UC:ultracentrifugation; UF: ultrafiltration


随后,研究者分别采用化学沉淀(ExoQuickTM 、Exo-spinTM)法、qEV尺寸排阻色谱(SEC)法和密度梯度离心(DG)法对细胞培养液和血浆中外泌体进行分离纯化,从而验证提纯方法的有效性和制备纯度,见图3。结果表明: ExoQuickTM 和Exo-spinTM两种沉淀方法所获外泌体纯度较低;而SEC和DG所获外泌体纯度则较高,但后者存在步骤繁琐,耗时等问题,分离效率较差,同样不适合大规模的样品分析。

图3 ExoQuickTM 、Exo-spinTM、qEV色谱柱和密度梯度离心的对比结果(b)外泌体量对比,化学沉淀法>qEV色谱柱&密度梯度离心(c)外泌体纯度对比,qEV色谱柱&密度梯度离心>化学沉淀法


在此基础上,为了评估外泌体分离技术的有效性,笔者又采用ExoQuickTM 、Exo-spinTM和qEV色谱柱对正常人血浆中的外泌体进行提纯,结果发现:ExoQuickTM 和Exo-spinTM获得的外泌体产率较高,但纯度较低,而SEC方法虽然产率不及上述两种沉淀方法,但却能够获得高纯度的外泌体。(2)从SEM图中可以看出,ExoQuickTM 和Exo-spinTM的杂质蛋白污染程度较为严重,而SEC方法并没有有出现白蛋白污染情况,且其生物活性较强,见图4。

图4 ExoQuickTM 、Exo-spinTM、qEV色谱柱的对比结果(a)外泌体尺寸分布与SEM图,ExoQuickTM 和Exo-spinTM的杂质蛋白污染程度较为严重,而SEC(qEV尺寸排阻色谱柱)方法并没有有出现白蛋白污染情况


图4 ExoQuickTM 、Exo-spinTM、qEV色谱柱的对比结果

(b)外泌体回收率对比,无显著性差异

图4 ExoQuickTM 、Exo-spinTM、qEV色谱柱的对比结果

(c)颗粒/蛋白比qEV显著高于EQ&ES

图4 ExoQuickTM 、Exo-spinTM、qEV色谱柱的对比结果

(d)Western blot分析对比


结论

1.传统的EVs 分离方法,如超速离心法和化学沉淀法,获得的EVs 纯度较低且成本较高,此外还需要特殊的设备,不适合大规模的样品分析。

2.qEV尺寸排阻色谱柱提供了一种有效、可重复性和可再生的标准化外泌体提纯方法,能够同时保证外泌体的含量、纯度以及生物活性。


参考文献:

Richard J. Lobb et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma [J]. Journal of Extracellular Vesicles 2015, 4: 27031. 


新西兰Izon Science公司最新推出用于分离、纯化和分析细胞外囊泡的标准化方法,该方法上游可以采用qEV尺寸排阻色谱柱进行外泌体分离纯化,下游可以采用纳米颗粒分析仪qNano进行物理表征(尺寸、浓度、Zeta电位),从而给科研工作者带来福音。


qEV尺寸排阻柱——生物样品中EVs 的分离

qEV采用尺寸排阻色谱(SEC)原理,利用溶液中颗粒尺寸的不同来吸附比外泌体更小的颗粒,如蛋白、脂类,使它们更加缓慢地通过柱子,从而达到分离和纯化的目的。


适用样品类型

* 血清

* 血浆

* 唾液

* 尿液

* 细胞培养介质

qEV主要优势

* 快速,分离时间仅需15min

* 纯度高,可去除99.8%以上的杂质蛋白

* 最大程度降低EVs的团聚

* 维持EVs的生物学功能

* 无添加剂,适合下游分析,如ELISA、电镜和RNA分析


上图为qEV 尺寸排阻色谱获得的馏分中EVs 个数浓度和蛋白浓度分析。EVs(粉色,馏分7-9)与杂质蛋白(紫、蓝色馏分11-30)可以得到有效区分。


qEV尺寸排阻柱种类

可控电阻式脉冲传感(TRPS)技术——EVs 的表征

TRPS 技术基于阻抗原理,与激光无关,检测对象为40 nm- 10 μm 的颗粒。对充满电解液的纳米孔上下两边施加一定的电压,孔内会产生离子电流。当颗粒通过纳米孔会取代一定的电解液增加电阻,继而产生电阻脉冲信号,通过该信号和校正颗粒的对比,来实现颗粒特征的逐个测定。

锘海生物科学仪器目前正在代理新西兰IZON纳米颗粒分析仪qNano,该仪器采用TRPS技术,可测定纳米颗粒和不同来源的EVs的颗粒尺寸、颗粒浓度和Zeta电位。该技术是目前用于纳米粒子表征功能最强大的技术,也是纳米粒子研究、发展和质控中非常重要的工具。

常规耗材

纳米孔膜与标准颗粒

不同规格纳米孔膜配合不同尺寸标准颗粒,定制用户不同样品的需要。

试剂盒

IZON试剂盒结合TRPS技术

* 简化实验操作

* 增加结果重现性

* 提高仪器性能及一致性


主要应用领域


药物递送载体

脂质体

聚合物药物

Delivery

PLGA

微生物

细菌

病毒

疫苗

细胞外囊泡

外泌体

微粒

全血细胞

红细胞

血小板

工业应用

聚苯乙烯颗粒

磁性颗粒

油漆涂料、乳液

金属粒子(TiO2、SiO2和黄金等


可测定颗粒特征

* 颗粒浓度和特定尺寸范围内的颗粒浓度,个数/mL

* 颗粒尺寸和不同尺寸的颗粒浓度,反映真实的颗粒-颗粒状态

* 颗粒电荷和不同电荷的颗粒浓度,同样反映真实的颗粒-颗粒状态

准确性和分辨率

右图为人工混合的三个不同大小的标准颗粒后用不同仪器测定的大小分布。对于多分散和非均匀体系,DLS和NTA技术的分辨率较弱,而DCS提供的粒径具有密度依赖性。四种测定技术中,仅有TRPS 技术能提供颗粒的真实粒径分布,且测定出不同峰值的颗粒浓度(如Cmin-Cmax)。

重现性

上图为分别测定三个不同大小的标准颗粒与其混合样品,测定结果高度重叠,具备高重现性,表明数据的可靠性,TRPS 技术很好的解决了因不同用户和不同仪器得到的结果可能会存在偏差的这类问题,将带动纳米领域的不断发展。


马上联系我们:

Tel:021-37827858

Http:www.nuohailifescience.com

E-mail:info@nuohailifescience.com












©Copyright 2017 锘海生命科学 沪ICP备17032315号