针对眼球血管的研究报道数量丰富，但大多关注于某个局部区域。在本文章中，作者开发了一套操作流程，借助光片显微镜可获取完整小鼠眼球血管的解剖结构，为相关发育和病理研究提供模型基础。
与众多使用光片显微镜成像的样本一样，文章中的眼球样本也需要进行相应的前处理，以达到光学透明的目标，使得光片显微镜的激发光能够到达需要成像的区域。具体流程涉及固定（Fixing）、脱色（Depigmentation）、免疫染色（Immunostaining）、透明化（Clearing）、成像并进行图像处理（In silico dissection）（图1）。为了使透明化更适合于眼球的透明，作者对现有EyeCi、EyeDISCO、DEEP-Clear透明化方法进行整合调整，并借助CD31抗体进行染色。
图1 获取眼球血管三维图像流程
小鼠眼球案例展示：
图2 小鼠眼球透明化对比图，采用锘海增强型组织透明化试剂盒制备
图3 小鼠眼球PI染色，使用LS18平铺光片显微镜进行整体3D成像
得益于良好的前处理和拍摄过程，作者借助计算机后期处理，对不同区域的血管添加不同伪彩，成功分离了出生后小鼠眼球（Postnatal mouse eye）的外周血管（Outer vasculature）、视网膜血管（Retinal vasculature）和玻璃体血管（Hyaloid vasculature）的解剖结构。
图4 小鼠眼球血管结构（蓝色：外周血管；黄色：视网膜血管；洋红：玻璃体血管）外周血管区域包含肌肉、虹膜和脉络膜。
在上述三部分血管系统中，作者重点考察了视网膜血管在小鼠出生后的发育情况。大约在P7阶段，即视网膜表层血管丛到达视网膜末端之前，内皮细胞（Endothelial cells，ECs）开始垂直地向神经元室（Neuronal compartment）生长以形成深层血管丛，并在之后非常迅速地在表层和深层血管之间形成中间层血管结构。通过三维成像结果，这些动态变化就可以被非常直观地观察到。图5展示了深层血管（洋红箭头）在表层血管（白色虚线）上逐渐发育的情况；而图6中则是该过程局部细节的展示。
图5 P8（D）、P10（E）、P12（F）阶段深层血管（洋红箭头）在表层血管（白色虚线）上的发育情况
图6 P8（G）、P10（H）、P12（I）阶段深层血管（洋红）和中间层血管（黄色）的发育过程
随后，作者考察了虹膜血管结构重塑与玻璃体血管结构退化的关系（图7）。在P4阶段，大部分玻璃体-虹膜（Hyaloid-iris）血管通过瞳孔膜（Pupillary membrane，PM）血管连接（图7A，箭头）；而到了P8阶段，瞳孔膜已基本退化，仅有少量残留血管隐藏在收缩的虹膜后，同时保留有一些虹膜-瞳孔膜（Iris-PM）血管，并在形成连接前已扩散至瞳孔区域（图7B，箭头）；在P12阶段，瞳孔膜结构消失，仅残留少许血管（图7C，三角箭头），并发现一些特殊的环状虹膜血管（图7C，箭头）；在成年后，瞳孔膜和玻璃体完全退化，血管不再指向或穿过瞳孔，而是形成拱形绕着瞳孔（Arching away）。此外，作者也展示了P5阶段的睫状后长动脉（Long posterior ciliary artery），该动脉在角膜缘区域分叉以供给血液和养分至虹膜区域（图7E、G）。对应的虹膜血管及细节图也进行了展示（图7F、H、I）
图7 均使用CD31标记的虹膜血管（黄）、前玻璃体与瞳孔膜血管（洋红）、葡萄膜和角膜缘血管（青）结构
该文章在眼血管发育和复杂眼病方面作了相当多的可视化和分析成果，这对于在全器官水平上观察眼球各区域相互作用大有帮助，同时也开辟了新的观察研究途径。
参考文献：
[1] L.T. Krimpenfort et al. Experimental Eye Research 237 (2023) 109674. https://doi.org/10.1016/j.exer.2023.109674
文献链接：Anatomy of the complete mouse eye vasculature explored by light-sheet fluorescence microscopy exposes subvascular-specific remodeling in development and pathology
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