前言
一个多世纪以来，医学诊断的黄金标准一直是基于组织病理学，它是对薄组织切片的检查，即将组织在玻片上染色后，用模拟明场显微镜进行可视化观察。很明显，切片的过程会破坏组织的结构信息（如图1），而有限的组织取样更是增加了调查和诊断的模糊性。近年来，人们重新认识到三维构型和空间环境对疾病研究与治疗指导的重要性。
图1.3D病理学克服了2D的局限性
传统光片显微镜
传统光学切片显微镜，如共聚焦和多光子显微镜，常用于高散射未清除组织的切片成像，偶尔也可以通过连续切片成像进行组织重建。此类显微镜具有较高的信噪比，但图像以逐点的方式生成，速度非常慢。尽管已经开发了各种方法来提高成像速度，例如共聚焦显微镜使用旋转磁盘，多光子显微镜使用时间聚焦或多焦点方法，但成像速度仍然阻碍了这些技术在高通量临床前或临床中的主流应用。
光片荧光显微镜
图2.光片荧光显微镜
光片荧光显微镜，通常使用薄的光片照射样品的焦平面上，经相机检测捕捉，获得样品各切面的图像信息。其成像信噪比高，速度快，光毒性、光漂白性低。光路的设计方式是多种多样的，不同的光路设计，限制了样品不同的成像深度或横移范围。如图2b，将两个物镜都放置在样品一侧可以最大限度地减少光学像差，但会限制样品的成像深度；又如图2c，在制备样品时需小心一些，以避免光学像差，但可以实现横向无约束成像，特别适合各式样品的高通量成像。
图3.人类淋巴结6通道成像
样品拍摄考虑
1、透明化处理
在进行大组织样本成像时，透明化过程就显得尤为重要。组织内部原有的非均质成分会导致光散射、光吸收等现象出现，降低了成像深度、也影响成像效果。可使用亲水、疏水等透明化方法，对样品进行透明化处理，使其达到透明均一的状态。
2、组织标记
组织标记建议在透明化过程之后进行。标记物及靶标的选择各式各样，而标记速度则与样品本身的尺寸及致密程度有关。如果是处理较薄的样品，也可以采用多轮成像的方法，中间进行抗体去除或荧光团漂白，此项技术已被证明可以进行几十个通道的标记成像（图3）。
3、成像时间与存储
大组织成像前，需要对图像的采集速率、信息存储空间、数据处理等方面进行必要的考虑。
通常，需要将数据集从本地采集工作站传输到更大的网络存储空间，本地固态驱动器充当临时缓存，其中，网络传输的速度或者原始数据压缩算法的速度应超过采集速度。成像数据集的大小及成像时间与空间分辨率的立方成正相关，所以，整体低倍与局部高倍拍摄的方式相结合，可更高效、多尺度的完成成像工作流程。
小结：
组织的3D成像，为临床病理学的应用提供了巨大的助力，不仅改善了临床决策，也提升了早期诊断以及预后的准确性。锘海生物为大组织的成像提供了整套的解决方案，包括透明化、平铺光片3D成像以及数据分析，期待能帮助客户解决更多的成像难题。
参考文献：
[1]Liu JTC, Glaser AK, Poudel C, Vaughan JC. Nondestructive 3D Pathology with Light-Sheet Fluorescence Microscopy for Translational Research and Clinical Assays. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 2023 Jun 14;16(1):231-252. doi: 10.1146/annurev-anchem-091222-092734. Epub 2023 Feb 28. PMID: 36854208.文献链接：Nondestructive 3D Pathology with Light-Sheet Fluorescence Microscopy for Translational Research and Clinical Assays
锘海LS18平铺光片显微镜采用平铺虚拟扫描光片技术，克服了传统光片显微镜中三维空间分辨率、信噪比和成像视野间的矛盾，可进行更高分辨率的三维成像。通过平铺技术可对光片状态进行实时调节和自动校准，保证其在不同应用中的易用性和稳定性。此外，根据不同样品的特性，LS18还分别提供了优化配件以及流程方案，方便使用者调整成像分辨率、速度、放大倍数等参数以及样本的处理方法，以获得微米级、亚微米级甚至百纳米级三维空间分辨率的多色组织结构信息。配套的三维图像分析软件和常用数据分析方案让使用者可更高效地对结果进行分析和解读，因此LS18被广泛应用于发育、肿瘤、神经等基础生物科研领域以及药物开发、药效检测、临床病理检测等医药领域。
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