RNA-LNP常通过两相自组装反应进行制备，一相为载体脂质相，另一相为包含API（活性药用成分）的水相，制备所需的设备则是我们已熟知的——微流控设备。
构效关系，可理解为药物的理化性质与其药用活性之间的联系。功效先行，理论滞后，是社会中常见的行事逻辑和行为方式，在mRNA-LNP研究领域也不例外，包括已上市的药物在内，其构效关系也未有清晰准确的阐明。
mRNA-LNP合成过程所涉及的微观动力学尚未清楚，而合成后mRNA-LNP表征手段的不足则更为构效关系的探索增添一份难度。诸多的疑问等待解答：单个纳米颗粒可以装载多少mRNA，mRNA-LNP的包封率和空壳率有着怎样的关系？后处理过程会改变脂质的分布吗？脂质本身的分布是怎样的？如何准确、定量地表征单个纳米颗粒的组分和载药量？这些问题的解答对于实验的设计，工艺的优化，质控的提升，临床风险的降低有着重要的指导作用。对于研究者而言，在细胞/动物实验的基础上，丰富表征手段仍为突破问题的核心。
如图1，mRNA-LNP有各式各样的结构模型，用一些常见的表征，如粒径、PDI、包封率检测等，很难了解其真实样貌。
图1. mRNA-LNP模型图
冷冻电镜（Cryo-EM）
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冷冻电镜适用于观测温度敏感型样品，是在普通透射电镜上加装样品冷冻设备，以降低电子束对样品的损伤，减小样品的形变，从而得到更加真实的样品形貌.
图2.LNP的Cryo-EM表征
图2中，A-C直观展示了纳米粒子（复必泰）的形态及粒径分布，也呈现了粒子内部的一些模糊形态；而D则更为清晰的显示出脂质体内水相中硫酸多柔比星晶体的棒状形态。
SAXS是指当X射线过样品时，在靠近原光束2°～5°的小角度范围内发生的散射现象。X射线穿过样品时，在不均一材料电子密度起伏的作用下，会发生散射并形成特定的散射图案，根据所得图案可反推样品微观结构。在进行mRNA-LNP表征时，SAXS常与Cryo-EM结合使用，正如图3所示，结合SAXS检测所得曲线与Cryo-EM拍摄所得图像，即可帮助研究者推断/验证诸多信息，如LNP的多层状结构，各种脂质的排布，纯化前后脂质排布的变化及不同脂质浓度、不同NP比对脂质排布的影响。
多激光圆柱照明共聚焦光谱（CICS）
此方法旨在从单粒子水平上定量解析LNP的有效载荷，通过对LNP不同组分荧光标签的一致性分析和单mRNA荧光的定量解析（图4），区分未封装的mRNA、空载的LNPs和负载mRNA的LNPs。以DLin-MC3基准配方来讲，不同条件下，LNP自组装的空载率为40%~80%，非空载的LNP大多含有2~3个mRNA分子。CICS为揭示LNP动力学控制提供了观测条件，也为mRNA-LNP构效关系的研究给予了新的帮助。
图4. LNP的CICS表征
单粒子分析器（SPP）
SPP采用市售共聚焦显微镜，基于溶液中数千个扩散粒子的荧光波动进行分析（图5a）。简而言之，荧光标记的粒子在衍射受限的观察体中扩散，其发射的荧光在多通道中被连续检测，使用自定义的免费Python脚本可识别多通道的荧光强度波动（图5b），基于多通道中每个单峰的强度，可以构建信号密度图（图5c）和每个通道的直方图（图5d）。
在包封分析中，SPP通过测量mRNA和脂质染料的共现信号（图5f），可以对单个LNP中mRNA的含量进行定量分析，以得到完整LNP的占比（图5g），以及单个LNP的mRNA包封量（图5h）。
图5.LNP的SPP表征
创建自组装动力学，完善表征手段是揭示mRNA-LNP构效关系的必要方式，文中提到的表征方法，对mRNA-LNP的研究起到了很大的帮助作用，相信随着科技的发展和相关理论的完善，此领域的研究将会取得更大的进展。
应用范围:
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