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案例分享|LS18平铺光片显微镜助力脑深部淋巴管受慢性应激调节的作用机制研究

发布日期：2023/6/20 11:26:30

研究背景：

脑膜淋巴管将脑脊液中的大分子、废物和免疫细胞排入外周淋巴系统的颈淋巴结，在衰老、阿尔茨海默病、帕金森病及创伤性脑损伤等脑部病变中受到调节。然而，淋巴管是否也能延伸到脑实质深处，以及淋巴管是否能受到生活压力事件的调节，目前尚不清楚。

2023年Nashat Abumaria和冯异老师团队在《Research》上发表题为“Characteristic Features of Deep Brain Lymphatic Vessels and Their Regulation by Chronic Stress”的研究文章，这项研究使用了组织透明化、免疫染色、全脑光片成像、脑厚切片共聚焦成像和流式细胞术证明脑深部淋巴管的存在并对其进行表征，并且研究了慢性压力如何影响这些淋巴管，为脑深部淋巴管的特征以及它们在压力生活事件中的调节提供了新的见解。

◆ 技术路线 ◆

检测小鼠大脑深处的淋巴管

利用组织透明化方法完成脑组织透明化及淋巴管标志物LYVE1的免疫染色，光片显微镜扫描后的三维重构结果显示在脑膜上检测到了LYVE1阳性信号，尤其是在上矢状窦周围(图1B)。光学切片显示，LYVE1信号也存在于大脑深处的皮层、小脑、海马、中脑和脑干中，类似于血管状结构，相比而言纹状体中几乎没有信号(图1C)。

进一步通过1mm脑厚切片进行验证（透明化、免疫染色和共聚焦显微镜成像，图1D)，同样观察到LYVE1信号不仅在脑膜区域，而且在皮层、海马和中脑中也被检测到(图1E)。此外，还发现CD34(血管标志物)和LYVE1标记的血管样结构平行，但LYVE1标记的血管样结构，其分支不如血管广泛(图1F)，而且没有红细胞(图1G)；T细胞（CD3标记）存在于LYVE1标记的血管样结构中(图H)。此外，LYVE1信号与其他3种淋巴内皮细胞标记物共定位，包括podoplanin、血管内皮生长因子受体3 (VEGFR3)和转录因子PROX1 (图1 I-K)。这表明，功能淋巴管不仅可以在脑膜结构内检测到，而且可以在大脑深处检测到。

图1 淋巴管存在于鼠脑深部

脑深部淋巴管的特征及分布

对LYVE1信号最强、最广泛的大脑区域(皮层、嗅球、海马、中脑、脑干和小脑)进行三维重构，并利用IMARIS软件的Filament and Surface算法显示脑深部淋巴管在每个脑区的起源及其分支、方向和直径(?)来分析其淋巴管。结果发现这些脑区淋巴管的平均直径在5 ~ 14 μm之间(图A ~ L)，淋巴管分支较少。

在不同的大脑区域中，嗅球、皮层、中脑背侧的淋巴管起源于脑膜内的淋巴管；在中脑深处，下丘脑腹侧的淋巴网络起源于大脑腹侧 (图G)。脑干淋巴管也发源于外表面，与硬脑膜垂直，在脑干中部深处(距外表面约450 μm，图H和图I)未检测到脑干淋巴网络。在小脑中，淋巴管是从小脑表面的淋巴网络生长出来的，延伸到小脑深处，并继续与表面平行(图J)。在海马体内，血管向背侧延伸，几乎覆盖了整个海马，在齿状回中观察到较低的网络密度(图2K)。在丘脑中与在皮层中观察到的非常相似(图2L)。

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脑深部淋巴管的特征

图2 脑深部淋巴管的特征

慢性应激调节脑深部淋巴管

为了研究脑深部淋巴管是否会受到外部环境因素的影响，作者将小鼠暴露于慢性不可预测的轻度压力下，并检查与精神/应激障碍有关的不同脑区脑深部淋巴管的变化。全脑成像和脑切片成像均显示：应激组小鼠海马全淋巴管、海马背侧淋巴管的长度和总面积减少，而淋巴管直径没有差异(图3A-J)。与海马结果相似，全脑成像显示慢性应激减少了丘脑淋巴管的长度和面积，但没有减少淋巴管的直径。在杏仁核中，慢性应激增加了淋巴管直径，但没有增加长度或面积(图3K至N)。

为了进一步证明脑深部淋巴管的存在及其在不同应激条件下的调节作用，作者采用流式细胞术检测淋巴管标志物，发现在对照小鼠的海马和耳(作为阳性对照)中可以检测到淋巴内皮细胞的2种标记物LYVE1和podoplanin(图3O)。免疫组织化学和影像学研究显示慢性皮质酮(慢性应激动物模型替代)治疗降低了治疗小鼠海马中lyve1阳性细胞的百分比 (图3P)。

综上，使用免疫组织化学、光片显微镜、共聚焦显微镜、流式细胞术、多种淋巴管标志物(LYVE-1、podoplanin、VEGFR3和PROX1)，以及2种不同的应激样病理动物模型，证明淋巴管可以在脑组织深处检测到，而且以脑区域依赖的方式受到应激生活事件的调节。

慢性应激下调脑深部淋巴管

图3 慢性应激下调脑深部淋巴管

VEGF信号可能参与应激对脑深部淋巴管的调节

慢性应激与炎症和免疫系统以及生长因子的变化有关。作者通过Western blot定量分析对照组和应激组小鼠海马中的炎症因子，发现破坏性炎症过程可能不是应激对海马深部脑淋巴管影响的主要因素（图A-D）。

VEGF-C信号在淋巴内皮细胞增殖和淋巴管生成中起重要作用，它可通过与sVEGFR2的裂解和可溶形式结合而被中和并变得无效。作者定量了应激组和对照组小鼠海马中VEGF-C、VEGFR3、VEGFR2 及sVEGFR2的表达，发现慢性应激未导致VEGF-C表达变化，但VEGFR2和VEGFR3下调表达，sVEGFR2/VEGFR2比例增加(图4E-I)。进一步使用免疫共沉淀实验，发现VEGF-C可以与小鼠海马中的sVEGFR2相互作用（图J)，应激组小鼠海马裂解物中VEGF-C::sVEGFR2/ VEGF-C::VEGFR2比值增高(图K和I)，表明应激组小鼠海马中大部分VEGF-C被中和，无功能。

综上，慢性应激可能通过两种方式降低海马淋巴管的VEGF-C信号活性：下调其受体的表达和减少VEGF-C可与其功能受体结合的数量。

慢性应激下调VEGF-C信号通路