二. Smart Batch⁺进行脱脂

1. “Delipidation Buffer（脱脂缓冲液）” 45°C”  24 小时（小鼠脑20mL，大鼠脑40mL）.

2. 一整瓶“Conduction Buffer”倒入样本仓。35mL “Delipidation Buffer” 加入样本杯。

3. 样本上机

4. 打开“Auxiliary Power（辅助电源）”，

5. 打开“Electrophoresis Power（电泳电源）”。

6. 按“Preset（预设）”直到显示“Clearing Mode（透明化模式）”。

7. 每 2-3 天更新“Delipidation Buffer（脱脂缓冲液）”。

8. 完全脱脂后，样本下机 ，PBS洗（将样本放在打光的底透台上，没有实心则透明化完成）

9. 清洗仪器

10.（不染色的话50% EasyIndex 24h，37°C ；100% EasyIndex 24h,37°C包胶成像）染色则不进行此步骤

实验：Day0 预孵育:

室温“Primary Sample Buffer过夜。

实验：Day1 一抗标记：

1. 样本上机。

2. 一整瓶“Primary Device Buffer”倒入样本仓。

“Primary Sample Buffer” 倒入样本杯，

3. 按照要求添加抗体、血清。

4. 将“Timer（定时器）”设为 18 小时。

5. 打开“Auxiliary Power（辅助电源）、“Electrophoresis Power（电泳电源）”和“Timed Shutdown（定时关机）”。

6. 按“Preset（预设）”，直到它显示“Labeling 1 （一抗标记）”

实验：Day2一抗洗涤和固定：

1. PH<8,下机（不小于8则延长下机时间）

2. PBS洗8h,每两个小时更换一次PBS。

3. 4%PFA室温振荡过夜

实验：Day3 PFA洗涤及二抗顺序标记

1.      被动洗涤6-8h，中间更换一次溶液，37°C

2.  按照要求添加二抗，Time设定为12h 。 

3． 打开“Auxiliary Power（辅助电源），“Electrophoresis Power（电泳电源）”，打开“Timed Shutdown（定时关机）”,“Preset（预设）”，直到它显示“Labeling 2。

实验：Day4 二抗洗涤及PFA固定

二抗洗涤

1．“Secondary Sample Buffer（SS#缓冲液）”装满样本杯

2. 将“Timer（定时器）”更改为 6 h,中间更换一次溶液。

3. 打开“Auxiliary Power（辅助电源），“Electrophoresis Power（电泳电源）”，打开“Timed Shutdown（定时关机）”。

4. 清洗设备，将样本放入PBS中室温振荡

PFA固定

1. PBS洗。4% PFA固定二抗 室温振荡过夜。

2. PBS 洗，更换一次溶液。

3. 您已经完成染色了！现在可以准备开始进行 折射率匹配 。

本实验方案需要使用 RI = 1.52 版本的 EasyIndex 。

1. 使用前建议将EasyIndex 过滤，消除里面的杂质。

2. 50% EasyIndex + 50% 蒸馏水中， 室温或37°C 下振荡孵育，过夜

3. 100% EasyIndex， 室温或37°C 下振荡孵育，过夜。

如果始终无法透明，则没有完全脱脂，只需将 EasyIndex 清洗掉并进一步透明化即可。