随着组织透明化技术和光片荧光显微技术的发展，3D荧光成像技术实现了快速获取3D组织信息的能力。光片显微镜由于其独特的3D成像能力以及更快的成像速度逐渐成为生命科学研究中3D荧光成像的强有力工具。光片显微镜的实现方式是将激发光片限制在探测焦平面内，使得激发光对样品的光漂白和光毒性降低，具有高的三维空间分辨率和良好的光学层析能力。

在光片显微镜中，光片越薄，光片层析能力越好，轴向分辨率越高；光片越厚，光学层析能力减弱，轴向分辨率变差。由于高斯光束的截面半径连线为双曲线，光片在沿着光传播的方向上无法一直保持厚度一致，光片较薄也就是轴向分辨率更好的一段被称为束腰。通常，我们以光片束腰的长度作为选择视野大小的依据。束腰的长度与光片的厚度是正相关的，要想获得更高的轴向分辨率，光片就需要更薄，束腰就会越短，相应的视场就越小；同理，想要获取更大的视场，光片就越厚，束腰更长，相应的光学层析能力减弱、轴向分辨率降低。那么如何制作一个薄且均匀的激发光片来覆盖大的FOV（Field of view），并尽可能将激发光限制在探测焦平面附近呢？

为寻求空间分辨率、光学层析能力和FOV之间的平衡，大限度地发挥光片荧光显微镜的3D成像能力，西湖大学高亮实验室提出了平铺光片技术的概念，旨在满足两个要求：首先，显微镜可以实现新的选择性照明光片，以便在不同的应用中发挥其优势，并且可以快速调整光片以实时优化成像性能；其次，可以在检测图像平面内快速平铺光片以扩大视野且不影响空间分辨率和光学层析能力。基于平铺光片技术，高亮实验室与锘海生命科学共同研制了新型平铺光片照明显微镜LS18。

传统光片显微镜的成像方式是怎么样的？

光片显微镜对一个大的样品组织进行三维成像时需要将样本细分成多个ROI（Region of interest）成像。这种方式本质上是光片显微镜中空间分辨率和视场大小之间的折衷。

如图1所示，在较大的FOV下，采用一个较长的光片激发成像，该方式成像的特点在于它的成像速度快，采集图像的数据量小，且整个样品被划分的ROI较少，图像三维重构相对容易。然而，由于此时用的放大倍数较小，视野大的同时，光片也较厚，因此光片的层析能力也大幅度降低，成像结果不但在横向上的分辨率较低，其轴向上的分辨率也更低。

图1 大的FOV下，传统光片显微镜成像模式

这时，研究者若想获取更高空间分辨率的3D成像数据，就需要使用更大的放大倍数并且采用更薄的光片。那么，成像的FOV缩小，样本成像细分的ROI将增多（如图2所示），导致样品在横向上的平移次数增加，此时采用的光片更薄，使得轴向上步进减小，样品成像的速度变慢。样品成像时间及采集数据大小会随着空间分辨率的增高而增加。此时图像重建工作量也将大幅度加大，主要原因有： 1. 采集数据大小明显加大；2. 需要在ROI之间做更多的图像拼合处理；3. 一些透明化方法处理的样品较软，且成像液的粘度较高，频繁移动可能使样品在成像过程中产生形变，给数据拼合增加困难。因此，样品在横向上的平移速度须足够慢，以尽量减少3D重建的问题，这就进一步降低了样品成像速度。

 图2 高分辨率下，传统光片显微镜的成像方式

什么是平铺光片技术？

平铺光片技术是一种新型的选择性平面照明显微镜（SPIM）三维成像技术，在不增加光片厚度、不降低激发光片约束能力的情况下，增加SPIM的FOV。如图3所示，在探测焦平面内沿光片长轴方向(y方向)平铺小而薄的光片，在每个位置拍摄一幅图像，将所有图像组合并重建整个FOV的图像。

图3. TLS-SPIM的工作原理，（左）通过快速平铺小而薄的光片，（右）在每个位置拍摄一幅图像，将所有图像组合重建整个FOV的图像。

LS18是如何实现快速高分辨3D成像的？

LS18光片显微镜采用平铺光片技术，通过对空间光调制器加载不同的相位图对激发光束进行调制，实现快速平铺短而薄的光片，扩大了FOV且不影响空间分辨率和光学层析能力，从而获得均一的高分辨率3D图像。而空间光调制器对激发光相位进行调制几乎可以解决所有的光片校准问题，实现显微镜仪器的自动校准，并且性能非常稳定。另外，根据不同样品的研究需求，LS18光片显微镜能够灵活地调整光片平铺次数以及成像速度，实现不同类型的完整组织器官的3D结构与功能测量。

如图4所示，相同的样本，平铺光片显微镜在较大的FOV下，快速平铺小而薄的光片，达到视野内成像分辨率均一，在不增加样本平移和图像重建问题的前提下，可以获得更高的空间分辨率、更好的光学层析能力和更快的成像速度。此外，平铺光片显微镜采用长工作距离、高数值孔径物镜和高分辨率检测相机，使得单个ROI视野尽可能大，并保持横向空间分辨率，从而尽可能地发挥使用平铺光片的优势。

图4 高的空间分辨率下，平铺光片显微镜的成像模式

参考文献：

1、Gao, Liang. Extend thefield of view of selective plan illumination microscopy by tiling theexcitation light sheet[J]. Optics Express, 2015, 23(5):6102-11.

2、Fu Q , Martin B L ,Matus D Q , et al. Imaging multicellular specimens with real-time optimizedtiling light-sheet selective plane illumination microscopy[J]. Nature Communications,2016, 7:11088.

3、Chen Y , Li X , ZhangD , et al. A Versatile Tiling Light Sheet Microscope for Cleared TissuesImaging[J]. bioRxiv 829267, 2020

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