近年来，微流控技术已成为新型冠状病毒疫苗后基因治疗纳米药物（Nanomedicines，NMeds）生产的主流技术；然而，对每种纳米药物类型和遗传物质进行优化仍然是该类药物研发的必备流程，且多为针对mRNA的方案。在此背景下，Ilaria Ottonelli等人尝试优化核酸脂质纳米粒（Lipid nanoparticles，LNPs）装载、保护和递送pDNA的方案，同时尽可能降低其毒性。

在文章中，作者首先探究不带阳离子脂质的中性脂质体（Liposome）。仅使用DPPC和胆固醇两种成分，通过改变配比发现更高比例的胆固醇能够获得更小粒径的脂质体，而流速比则基本不会影响脂质体性质。因而敲定DPPC与胆固醇的比例为1：1。之后作者引入阳离子脂质DOTAP与带荧光的脂质DOPE-Rhod，以形成空包的脂质纳米粒（Lipid nanoparticles，LNPs）。通过不同的配比，发现在阳离子脂质比例不高的情况下，LNP的粒径与PDI均保持良好，但在加入荧光脂质后，粒径和PDI均有正相关趋势（图1）。在共计12组实验中，DPPC : Chol : DOTAP = 1 : 1 : 0.1，且加入定量10 μg荧光脂质的粒径和PDI较为理想，因此后续的实验作者均使用了该配比。

图1 不同比例的DOTAP与DOPE-Rhod对LNP粒径和PDI的影响

目前对于合成包裹有核酸的脂质纳米粒，较为主流的方法是将核酸作为水相的成分，在形成脂质纳米粒时直接进行包裹。但也有些科研工作者使用与传统转染试剂盒类似的方式，先合成空包的脂质纳米粒，再与核酸进行“孵育”，使核酸与脂质纳米粒结合，形成最后具有功能的LNP。在文中，作者将前一种主流方法称为“前添加法（Pre-addition strategy）”，而后一种成为“后添加法（Post-addition strategy）”（图2），并比较了这两种方法合成的LNP的表征结果（图3）。

图2 两种合成最终LNP方法的比较图

对于含有阳离子脂质的脂质纳米粒，使用“后添加法”包裹不同量的核酸（5 – 15 μg/mL），其粒径和PDI随着核酸浓度的提升而线性增加（150 nm，PDI ~0.1变化至250 nm，PDI＞0.4）。尽管保持几乎100%的结合率，但作者认为其稳定性极差，无法用于后续的实验。而使用“前添加法”，包封率仍能保持近乎100%，且核酸量的增加并不会对LNP的粒径和PDI造成明显影响。因此作者持续增加核酸浓度，直到100 μg/mL才出现了负面影响，但仍然要好于“后添加法”。同时Zeta电位开始下降，这可能与LNP内部核酸接近饱和，开始聚集在粒子表面有关。另外，该“不理想”的LNP稳定性较好，4℃保存30天后的粒径和PDI仍十分稳定。

图3 带有阳离子脂质的脂质纳米粒包裹pDNA表征结果

鉴于上述结果，作者也尝试使用中性脂质体进行pDNA的包裹（图4）。与预料类似，因缺乏能与核酸进行静电吸附的阳离子，中性脂质体包裹效果差于阳离子脂质纳米粒。其中使用“后添加法”进行pDNA包裹，其结合率极低（＜5%）；“前添加法”尚且能达到50%左右的包封率，且粒径（150 nm）和PDI（＜0.15）处于可接受范围内。

图4 中性脂质体包裹pDNA表征结果

结合上述各实验我们不难发现，使用“前添加法”，例如微流控等一步合成方法，具有较为优越的粒径、PDI、包封率以及稳定性，是合成各类核酸脂质纳米粒的首选方法。

此后作者也同样进行了核酸酶保护、毒性和细胞摄取等测试，发现该LNP同样具有低细胞毒性（40 μg/mL）和快速细胞摄取（2小时内）的特性，再次验证了LNP作为基因治疗工具的能力。

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