论文链接：Optical Clearing and Light Sheet Microscopy Imaging of Amphioxus
头脊索动物，如文昌鱼或箭鱼，代表着脊索动物门中最为原始的分支。它们在发育和解剖学方面的研究为理解脊椎动物的进化历程提供了至关重要的参考。通过丰富文昌鱼这一模型系统中的方法学工具，可以极大地推动其在演化发育生物学领域的应用。文昌鱼的进化研究需要对其解剖学特征进行深入探究。尽管传统的共聚焦显微镜技术可以观察到透明的文昌鱼胚胎和早期幼体，但在后期发育阶段，由于个体体积的增大和不透明度的提高，成像工作面临挑战。
本研究中，作者展示了一种结合光片显微镜和组织透明化技术的方法，用于探索大型文昌鱼样本，同时确保样本的表面和内部结构保持完整。研究团队利用文昌鱼幼体的自发荧光来凸显解剖学细节，并运用针对黑视素和乙酰化α-微管蛋白的抗体标记，以明确杆状感光细胞和神经元框架。
该研究方法将光片显微镜、组织透明化技术、文昌鱼的自发荧光以及抗体免疫检测相结合，实现了对整个动物解剖结构的三维可视化，甚至能够观察到单个细胞层面。研究结果表明：
1、透明化技术显著提高了文昌鱼幼体的透明度，使得原本在样本背景中不可见的色素细胞在透明化后变得清晰可见。
2、肠道和额眼区域的自发荧光最为强烈，整个组织中均匀分布着蓝色的自发荧光。488nm和638nm激光诱导的发射主要出现在背侧组织（如臀鳍）、肠道和鳃部。红色自发荧光在肠道中尤为显著。联合免疫荧光（IF）染色显示，与内源性荧光相比，激发DAPI或Alexa 488所需的激光功率要低三倍，因此自发荧光不会干扰外源性标记的成像。
3、除了在口腔中检测到信号外，3个月大的幼鱼与1个月大的幼体相比，自发荧光的强度较低。在蓝色通道中，自发荧光几乎无法检测，因此DAPI染色有助于获取整个样本的清晰轮廓。DAPI信号在所有组织中均有发现，尤其是在神经管、腭部、鳃裂和肠道中的信号最为强烈。
4、幼鱼的自发荧光信号在3个月和6个月大的样本中显示出许多相似之处。光学切片图显示，脊索中的信号强烈，可以作为内源性标记物。
这项研究不仅为文昌鱼的解剖学研究提供了新的视角，也为其他头脊索动物的研究提供了一种高效、多维度的成像技术。通过这种方法，研究人员能够更深入地理解这些生物的复杂结构和发育过程，为脊椎动物的进化研究开辟了新的途径。
图 1.CUBIC方法对文昌鱼仔稚鱼的透明化。（A）透明化前和（B）透明化后的1个月龄仔稚鱼，（C）透明化前和（D）透明化后的3个月龄仔稚鱼，以及（E）透明化前和透明化后（F）后的6个月龄仔稚鱼。所有样本均来自同一批次，，并在相同的条件下饲养。使用宽视场显微镜通过透射光对所有样本进行成像。比例尺0.5mm。
图2.1月龄的两栖仔稚鱼的自发荧光和抗乙酰化α-微管蛋白染色。（A-D）分别在蓝色（405nm）、绿色（488nm）、红色（561nm）和洋红色（638nm）通道下对其自发荧光进行了单独成像，（E）为四通道合成图像。图像显示出仔稚鱼长约2.9mm，具有7个不成对的鳃缝。（F-Q）1月龄仔稚鱼乙酰化微管蛋白的免疫荧光染色。（F-K）两个不同个体的整体图像。其中仔稚鱼1长约2.7mm，具有7个不成对的鳃裂；而仔稚鱼2长约3.5mm，具有8个不成对的鳃裂。（L）从左侧视图看仔稚鱼1前部的细节。（M）从背外侧视图看仔稚鱼1的脑神经细节。（N）从背视图看仔稚鱼1前部的细节。（O）从左视图看仔稚鱼2的前部细节。（P）从腹侧视图看仔稚鱼2前部的细节。（Q）从腹侧视图看仔稚鱼2的脑神经和脑囊泡的细节。仔稚鱼1和2来自同一批次，并在相同的条件下饲养。所有荧光图像都代表整鱼的3D重建。图像中信号强度低的规则区域是由于成像过程中落在相机边缘的较低光强度引起的。
图3.3月龄的两栖幼鱼的自发荧光和抗乙酰化α-微管蛋白染色。（A）对自发荧光的样本进行DAPI染色。对（B）绿色、（C）红色和（D）洋红色通道发出的幼鱼自发荧光的单独成像。四通道图像的（E）侧视图和（F）腹视图。自发荧光成像的样本长约8mm。（G）在（H-I）中对样本进行DAPI染色。（H-N）乙酰化微管蛋白的IHC染色。染色的幼鱼长8mm。（J,K）免疫染色幼鱼的腹面视图。（L,M）免疫染色幼鱼前部的前外侧视图。以证明与（M）乙酰化微管蛋白染色相比，需要对绿色通道的亮度/对比度进行差异调整，以显示（L）触须中内源性 GFP 信号的强度。（N,O）从侧视图看免疫染色幼鱼后部的细节。（P,Q）心柱神经分布的腹面视图。所有荧光图像都代表整鱼的 3D 重建。
图4.6月龄两栖幼鱼的自发荧光和抗乙酰化α-微管蛋白染色。（A）长度为 10.5mm的6月龄幼鱼的DAPI染色。同一个体（B）绿色、（C）红色和（D）洋红色通道的自发荧光。（E）从侧面视图合成图像。样本的（F）水平或（G）横向光学层切图，在脊索区域显示绿色、红色和洋红色通道中的 DAPI 染色和自发荧光，并合成上述所有图像（从左到右）。（H–Q）对长度为9.7mm的6月龄幼体的乙酰化微管蛋白进行IHC染色，分别为（H-K）整鱼层切图和（L-Q）局部层切图。（O-Q）去除口笠触须的幼体前段光学层切图细节的左侧视图。
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