在生物3D打印中，结合细胞生物学和生物材料学并应用于组织工程和再生医学已颇具规模。层出不穷的新颖打印材料往往具有一定精准的生理特性，使得控制细胞在打印前后的存活、状态、变化规律等成为可能。因此通过这些材料构建三维生物组织，我们可以专注于成熟、未成熟细胞的体内微生理环境（Microphysiological environment），例如健康或病理状态下细胞的生长、分子的清除和相互作用等。

我们需要对生物和非生物成分都有清晰的理解和控制，否则会导致细胞存活率等结果有巨大差别。一个比较基础的方向是研究细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）的影响，从非生物成分（即材料）方面，可以通过以下特性进行调整：

1、表面特性：形貌（Topography，如微米、纳米级）

2、力学特性：模量（Modulus）、柔软度（Softness）

3、形态特性：多孔（Porosity）、形状（Shape）

4、电学特性：通过材料刺激或细胞内离子流动影响

而在生物成分上，优化和质量保证的细胞处理过程始终是至关重要的点，因此我们需要对其进行质量控制（Quality control），即从细胞最初的获得与保存开始，细胞培育，打印前与其他材料的混合，到打印后在打印的支架上培养、分化、表征全程都需要严格的把控。

图1展示了以诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell，iPSC）为例的细胞准备过程。该流程系作者基于之前发表的文章中关于cGMP临床级人类胚胎干细胞分化、保存流程稍作调整获得，着重于流程对于不同种类细胞的普适性，并可通过加入多个确认环节降低风险^[1]。确认方式可以是简单的宽场显微镜观察，也可以是更为复杂的实验方法，诸如染色体核型异常（Karyotyping chromosome anomaly）、内毒素测试（Endotoxin testing）等。

图1 iPSC细胞系分化、培养及储存的质控流程图

在图1中，作者首先进行的是滋养层细胞（Feeder cell）的培养。滋养层细胞指一些特定细胞（如颗粒细胞、成纤维细胞等已在体外培养的细胞），经有丝分裂阻断剂处理后所得的细胞单层。在这一层滋养细胞上，干细胞能够更好地附着、生长。在将体细胞重编程并获得克隆细胞群后，进行机械繁殖（Mechanical propagation）过程，并最终获得iPSC。机械繁殖是通过细胞刮刀或组织切片机将完整培养基及培养的细胞切成若干区域，而后转移至新培养皿进行培养增殖的过程^[2]（图2）。

图2 A：机械繁殖流程图。B：（i）用胶原酶增殖的人胚胎干细胞；（ii）McIlwain组织切片机；（iii）改进型斩臂（箭头）；（iv）切割后的单个细胞群显微图。

C：使用自动剪切（i、ii）和酶传代（iii-iv）传代后的代表性细胞群片段。比例尺100 μm。

基于图1的iPSC准备过程，图3展示了其后续生物3D打印流程。需要注意的是，不论细胞还是生物材料，都需要保证其无菌性，以减少整个过程中的污染风险。

图3 生物组织3D打印的质控流程图

[1] Estermann M., Bisig C., Septiadi D., Petri-Fink A., Rothen-Rutishauser B. (2020) Bioprinting for Human Respiratory and Gastrointestinal In Vitro Models. In: Crook J. (eds) 3D Bioprinting. Methods in Molecular Biology, vol 2140. Humana, New York, NY.

https://doi.org/10.1007/978-1-0716-0520-2_13

[2] Joannides, Fiore He′riche′, Westmore et al Automated mechanical passaging: a novel and efficient method for human embryonic stem cell expansion. Stem Cells. 2006 Feb;24(2):230-5. doi: 10.1634/stemcells.2005-0243. PMID: 16510428.

[3] https://zhuanlan.zhihu.com/p/532219873

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