之前说到光片显微镜以其较高的三维空间分辨率、良好的光学切片能力和较高的成像速度而备受关注。但是由于衍射极限导致的光片形状限制（见光片技术小课堂二2.1），当需要大视场时，会导致较低的轴向分辨率或较差的光学切片能力。因此，如何产生出厚度均匀且薄，又大到能覆盖视场的激发光片成为光片显微镜的关键问题。目前已经有很多不同的方法来尝试在光片显微镜中产生这样的光片，例如高斯光片、贝塞尔光片和晶格光片。然而无论采用何种方法，这种光片自身特性的相互限制对所有类型的光片都是存在的，而且当我们需要用亚微米厚度的光片去对几十微米或更大的视场进行成像时，这个问题尤其具有挑战性。
Dean和Fiolka首先提出了一种解决方案，通过使用聚焦可调的透镜沿光的传播方向扫描激发光的焦点，从而可以创建长而均匀的虚拟激发光束，并且可以通过扫描虚拟激发光束进一步生成大而均匀的虚拟激发光片。但是这种方法有两个局限性，首先是由于扫描过程中激发光束尾迹的混合使得用这种方法产生的光片对激发光的限制很差，因此光学切片的能力较差，需要与共焦检测一起使用以抑制荧光背景；其次，由于产生的激发光片是一个虚拟光片，因此在一个相机曝光周期内，焦点需要扫描整个视场，因此在视场内任何特定位置的实际曝光时间都非常短，需要使用相对较高的激发功率才能产生足够的荧光信号，从而导致更强的光毒效应。
在这之后，西湖大学的高亮博士提出了一种在不增加光片厚度或降低光约束力的情况下提高光片显微镜视场的替代方案。如图1所示，可以通过沿光片长度方向在检测光路的焦平面内平铺光片并在每个位置拍摄图像来代替使用较大的激发光片对大视场进行成像。然后，将所有图像组合在一起，重建整个视场的图像。尽管这种方法降低了成像速度，但其所带来的好处是显而易见的，采用更薄的光约束能力越好的光片对同一样品进行成像，可以获得更高的轴向分辨率和更好的光学切片能力。
图1 该图展示了该方法的工作原理，同样的视野可以通过沿着光片长度方向平铺更小但更薄的光片并拍摄额外的图像来成像。
为了在实际中实现这一方法，在成像过程中样品或激发光束必须沿光束方向快速移动。高亮博士选择通过使用纯相位空间光调制器（spatial light modulate, SLM）对光束进行离焦来移动激发光束，因为无论是移动样品还是激发物镜都太慢。此外由于光片显微镜中激发物镜和检测物镜之间的物理约束，激发物镜的NA通常小于0.6，因此激发光束可以在对其横向光强分布影响很小的情况下离焦几百微米。
接下去高亮博士在前期严格的数字模拟后通过两个实际成像实验验证该方法的可行性，首先
是用1.5%琼脂糖凝胶包埋100nm黄绿色荧光粒子来验证该方法的成像性能，结果如下：图2(a) – 2(c)展示了在三个不同激发光束位置（左、中、右）下为同一视场采集的三个三维图像堆栈的轴向更大值投影；图2(d) – 2(f)展示了相应的去卷积图像结果；图2(h) – 2(m)展示了选定的相同荧光粒子在去卷积前后的高分辨率对比视图，以及每个选定粒子的轴向强度图。
图2 用平铺光片方法对嵌入琼脂糖凝胶中的荧光粒子进行三维成像。(a-c) 在激发光片分别位于视场的左侧(a）、中间(b)和右侧(c)时的同一视场下的YZ更大值投影；(d-f) YZ去卷积后的更大值投影；(h-m) 同一视场不同区域中所选荧光粒子的放大视图与轴向强度图；比例尺：a为5μm，h为1μm。
如图2所示，在每个光束位置由于与视场相比激发光束长度更短，因此在相应的子区域中获得了比其余区域更高的轴向分辨率，通过在三个位置平铺激发光片，可以在整个视场内获得~500nm的均匀轴向分辨率。
第二个实验通过对在3折叠期的活体线虫胚胎成像进一步证明了其成像性能。在这个阶段，胚胎内大约有550个细胞，这种胚胎的细胞结构非常致密，它会引起强烈的光学像差和散射。为了获得具有亚微米轴向分辨率和高信噪比的三维图像，需要具有良好的光学切片能力。在三个位置之间移动相同的激发光束以成像整个胚胎，胚胎的横向更大值投影如图3(a)所示。为了更好地揭示胚胎的内部细胞结构，图3(b) – 7(d)展示了在不同光束位置下沿水平虚线的胚胎截面图，图3(e) – 3(g)展示了沿三条垂直虚线的胚胎截面图。尽管胚胎的结构复杂，光学像差大，但由于使用了具有良好光约束力的薄激发光束，通过移动激发光束并拍摄额外的图像，整个胚胎能够如预期那样以~500nm的轴向分辨率和高信噪比成像。
图3 用平铺光片方法对3折叠期线虫胚胎进行了三维成像。(a) 胚胎XY更大值投影；(b-d) 在激发光片位于胚胎的左侧(b)、中间(c)和右侧(d)时胚胎沿(a)所示水平线的YZ截面图；(e-g) 沿(a)所示三条垂直线处的胚胎XZ截面图。比例尺：a为5μm，b和e为2μm。
高亮博士在该研究中提出并展示了一种新型光片显微镜进行的三维成像方法，能够在获得高三维空间分辨率和良好的光学切片能力的同时获得大视场。与以前实现这一目标的解决方案相比，它没有试图扩展光片的尺寸至足够覆盖整个视场，而是通过使激发光束离焦并拍摄同一图像平面的多个图像，将相对较小的激发光片平铺到多个位置。通过这个方法，在只降低成像速度的情况下能获得具有更薄厚度和更好的光约束力的光片。高亮博士提出的方法是很有价值的，首先，尽管已经引入了不同种类的光片来提供对该问题的解决方案，但这些方案无论是使用什么方法产生的激发光片，仍普遍是将光片变得更厚或者增加光片的尺寸导致光约束力（即光学层切能力）变得更差，这样的思路由于光的衍射极限的限制，不可能有更好的解决方案。因此，该方法是在轴向分辨率、光学切片能力和视场均不受影响的前提下，提供的一种新的策略。其次，所提出的方法对任何类型的光片显微镜都是有效的，这意味着使用同一种尺寸较小、厚度较薄且光约束能力较好的光片，可以从同一样品中获得更高的轴向分辨率和更好的光学切片能力。
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参考文献：（点击“阅读原文”参看文献）
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