4.数据的获取

由于每种显微镜各自不同的特点，用户的使用体验也是不同的。光片显微镜的使用体验可能感觉与传统显微镜特别不同，因为大多数设置都是完全数字化的，没有目镜，所以无法通过眼睛快速检查样品的位置和方向。此外，位移台的控制可能与传统显微镜的界面也有很大不同。快速扫描样品整个深度的能力，无需像共聚焦显微镜那样等待扫描完成，使得光片显微镜的工作流程快速且直接。同样，快速的数据获取速度使得实验能够快速连续地进行。然而，快速的数据获取会导致大量数据迅速积累，用户需在谨慎考虑数据存储与数据处理能力的情况下方可进行长时间拍摄。

4.1确定样本方向

在普通的宽场荧光显微镜中，安装好的样品被放置在显微镜台上，然后从上面或下面（垂直或倒置）进行照明和检测。光片显微镜由于可以拥有不同的照明路径，给样品的放置增加了另一个自由度，从而允许用户准确定位样品。此外，多组数据可以从不同的路径获得，并拼合在一起，也能使显微镜的穿透深度固定的情况下获得更大的成像范围。同时，在光片显微镜中，样品的放置方向也比经典的单透镜显微镜更为重要。用户需要使样品相对于照明轴和检测轴方向正确：光片需要在不通过样品的高折射或高吸收结构的情况下到达感兴趣的区域。

4.2光片校准

与传统荧光显微技术不同的是，图像采集过程中的第一个关键步骤是光片的校准。在光片显微镜中，我们需要辨别调整光片的基本参数，即高度和厚度，以及正确地将光片定位在检测透镜的焦平面上。这三个步骤对于获得光片好的层析能力以及可靠性、一致性高的结果都是必不可少的。此外，光片的校准和对其参数的了解可能是决定进一步实验策略的关键性先决条件，例如调整轴向的步进和之后的分析步骤。

① 调整光片的宽度

光片需要覆盖视野的整个宽度，在使用扫描光片的情况下，可以通过设置扫描振幅较容易地调整此属性。如果是静态光片，则必须扩大照明光束。入射光束的强度分布通常遵循高斯模式，只有光束的中心部分被认为是均匀的。对于光片宽度的限制通常使用狭缝光阑，以避免视野之外不必要的激光输入。

② 调整光片的厚度

如之前所说，光片的厚度定义了轴向光学截面的范围。光片越薄，沿光束传播轴的束腰范围越小，因此可用视野越小（图2-1A和B）。这些光片特性通常由光学元件决定，通常在仪器的设计过程中进行选择。用户只需在实验前确认光片的的正确校准即可（图4-1A）。

③确认光片位置

一旦决定了来为所需视野提供光片的照明物镜，则需要对光片进行校准。第一步是沿着光片射入的方向平移光片，直到它在视野中居中（图4-1B）；第二步是要使光片在检测路径的焦平面上（图4-1C）；第三步需要确认光片在整个视野内与焦平面重叠（图4-1D）。

图二.png

图 2-1 光片的特性与生成（A）薄薄的光片只能在小范围内产生均匀的光照；（B）相比之下，只有较厚的光片才能获得较大的视野；（C）光片可以由圆柱形透镜一维聚焦激光束（静态光片）或通过快速扫描激光束穿过视场（扫描光片）生成。

图四.png

图4-1 光片校准（A）（从上方）校准良好的光片；（B）光片束腰位置需要在视野中央；（C）光片需要精确地放置在检测物镜的焦平面上；（D）照明轴需要与检测轴正交。

4.3选择正确的成像参数

光片显微镜具有速度快、光毒性低的特点，可以在不影响样品的情况下对多个平面或多个时间点进行成像。虽然人们可能会追求更高的空间和时间分辨率，但产生的数据量是巨大的；因此，需要有数据存储和强大的计算能力来处理和归档数据。与其他显微镜技术相比，在使用光片显微镜时，用户需要在实验前考虑必要的信息量。

需要考虑的采集参数有：

光片厚度
轴向步进
相机的曝光时间和区域
激光照明功率
拍摄帧速
多视图采集

用户需要在图像质量和数据大小之间找到适当的平衡。较薄的光片提供了好的轴向分辨率，但需要拍摄更多数量的图片。较短的曝光时间和光照时间可以减少移动样本时的运动模糊，提高时间分辨率，但在相同的信噪比下，每帧需要更高的激发能量，意味着需要使用更高的激光功率。同时，提高帧速会在提高时间分辨率的同时也会增加数据量。光片显微镜的一个特点是能够从不同方向拍摄样本，当拍摄的样品太大而无法从一个方向完成成像时会非常有用。多视图采集后的三维重构还能在一定程度上弥补单向成像中由于光片在样品内受到影响导致的瑕疵和失真，从而达到提升分辨率的效果。

参考文献：

1.Huisken,J., & Stainier, D. Y. R. (2007). Even fluorescence excitation bymultidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM). OpticsLetters, 32(17), 2608–2610.

2.Preibisch,S., Saalfeld, S., Schindelin, J., & Tomancak, P. (2010). Software forbead-based registration of selective plane illumination microscopy data. NatureMethods, 7(6), 418–419. http://dx.doi.org/10.1038/nmeth0610-418.