继显微成像小课堂后，锘海光片技术小课堂也正式开课了，在以后的时间里我们会介绍光片显微镜的一些关键概念和成功应用。我们会持续推广科普新的成像技术，以更好地服务广大生命科学工作者。

光片显微镜的原理

光片显微镜的基本结构是结合了两条相互正交的不同光路，一条用于快速宽视场的检测，另一条通过一片薄光片用于照明。一般来说，光片处于检测路径的焦平面上，光片的束腰处于视野的中心（图1-1）。

图1-1 照明与检测物镜相互正交，样品置于两个物镜焦平面的相交处，样品的其中一小片会被一片薄薄的激光光片所照亮。从图中的上方往下看，光片束腰应在视野的中心位置且与检测路径的焦平面完全重合。

光片照明

选择平面照明显微镜（Selective Plane Illumination Microscopy, SPIM）的特殊结构解决了单镜头结构的两条基本限制：

(1) 在低数值孔径（NA）的物镜中获得很薄的光学切面是非常困难的；

(2) 在对样品的单个区域进行成像时整个样品都处于被激光照亮的状态，这会增加数倍荧光漂白和光毒性的可能：在获取样品的N个平面信息的同时，每个平面都在激光下曝光了N次（图1-2A）。

相比之下，在SPIM中，只有检测物镜的焦平面被选择性地照亮（图1-2B），这能有效使得样品接收的激光能量输入减少。在获取N个平面的信息时每个平面也只会曝光一次。光片的厚度决定了轴向光学切面（XY面）的厚度，然而SPIM的光片厚度比普通显微镜技术中检测物镜的景深要薄得多。因此，通过光片显微镜，我们可以在大样本中获得大视场且薄的光学切片。

图1-2 与共聚焦激光扫描显微镜相比，光片显微镜有许多优势。（A）在使用共聚焦显微镜时，即使只成像单个平面，整个样品也会被均匀得被激光照亮；（B）在使用光片显微镜时只有检测的目标平面才会被选择性地照亮；（C）在使用共聚焦显微镜时，激光检测点需要扫遍整个样本后获得一张图像；（D）在使用光片显微镜时，整个视野范围同时检测从而可以在短时间内获得一张图像；（E）在光片显微镜的横向分辨率与宽场荧光显微镜相同时，因为光片照明技术，光片显微镜的轴向分辨率会显著提升（在10×/0.3的镜头下，分别可以达到共聚焦显微镜与宽场荧光显微镜的2倍与2.5倍）。

宽视野检测

由于其光学构造，光片显微镜还提供了另一个优势。在使用共聚焦显微镜时，需要通过小孔进行信号识别，因此需要进行非常耗时的逐点扫描（图1-2C）；而在使用光片显微镜时，可以在一次曝光中用一个穿过整个样本的光学切片获得整个平面的图像（图1-2D），在整个曝光期间内（通常是几毫秒）每个像素点都在收集光子。相比之下，在使用共聚焦显微镜成像时，扫描设备需要从一个像素点快速移动到下一个，在这之间只能停留几微秒。因此在光片显微镜成像时，所有像素平行记录的效率非常高，这可以使得在成像时样本的局部激发强度可以保持很低的水平。此外，如果配合速度更快且灵敏度更高的相机，光片显微镜获取非常大的图像数据组的能力会比其他任何技术都快得多，同时仍然保证了较高的信噪比和小的光毒性。这使得光片显微镜成为在对敏感活体组织造成少侵入的同时对其进行快速动态发育过程追踪的技术。

 大样本

光片照明在对大样本进行成像时用低NA、低放大率和长工作距离物镜的显微镜尤其有利。在光片显微镜的横向分辨率与宽场荧光显微镜相同时，轴向分辨率主要由光片厚度决定。例如，如果同时使用10×/0.3的镜头，光片显微镜的轴向分辨率可以达到共聚焦显微镜的两倍。

参考文献：

1. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., & Stelzer, E. H. K. (2004). Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science, 305(5686), 1007–1009.

2. Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., & Stelzer, E. H. K. (2008). Light sheet-based fluorescence microscopy: More dimensions, more photons, and less photodamage. HFSP Journal, 2(5), 266–275.      

3. Weber, M., & Huisken, J. (2011). Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics & Development, 21(5), 566–572.

4. Engelbrecht, C. J., & Stelzer, E. H. (2006). Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Optics Letters, 31(10), 1477–1479.